一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?br />1、 了解大腸菌群在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的意義。
2、 學(xué)習(xí)并掌握大腸菌群檢驗(yàn)的原理和方法。
二、原理
大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括：大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。
食品中大腸菌群數(shù)系以每100g（或ml）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（the most probable number-簡稱MPN）表示。
三、試劑和儀器
（一）準(zhǔn)備的器材
規(guī)格名稱 數(shù)量 用途
1、500ml廣口瓶 1個 稀釋樣品
2、500ml三角瓶 2個 制生理鹽水
3、250ml三角瓶 1個 制EMB瓊脂
4、18×180mm試管 8支 稀釋及制雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管
5、18×150mm試管 20～25支 單料乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管
6、13×130mm試管 20支 制蛋白胨水、EC肉湯
7、1ml移液管 5 支
8、10ml移液管 3 支
9、直徑為90mm平皿 　　　　12套 　制EMB平板
10、250ml量筒 1支
（二）應(yīng)滅菌消毒的器材
剪刀1把 開瓶器　　不銹鋼藥匙1把 滴管膠頭4只　　稱量紙適量
（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基
培養(yǎng)基總量 所用容器
1、 0.85%NaCl生理鹽水 300ml 　　500ml三角瓶
2、 乳糖膽鹽發(fā)酵管
雙料： 10ml/支 5支 60ml 18×180mm試管(裝有導(dǎo)管)
單料： 10ml/ 8支 90ml 18×150mm試管(裝有導(dǎo)管)
3、 EMB瓊脂： 1瓶 120ml 250ml三角瓶
4、 乳糖發(fā)酵管： 3ml/支 5支 20ml 13×130mm試管(裝有導(dǎo)管)
5、 EC肉湯： 3ml/支 6支 20ml 13×130mm試管(裝有導(dǎo)管)
6、 蛋白胨水： 2ml/支 10支 20ml 13×130mm試管
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
（天） 樣品處理及初發(fā)酵接種：
所需培養(yǎng)基與器材：
u 培養(yǎng)基：
1. 0.85%NaCl生理鹽水： 300ml 1瓶
2. 乳糖膽鹽發(fā)酵管
雙料： 10ml/支 3～5支 18×180mm試管(有導(dǎo)管)
單料： 10ml/支 6～8支 18×150mm試管(有導(dǎo)管)
u 滅菌器材：
500ml廣口瓶（內(nèi)帶5mm帶玻璃珠） 1～2個
18×180mm試管 3支
250ml量筒 1支
1ml移液管 5 支
10ml移液管 3支
當(dāng)樣品袋裝樣品時：消毒酒精、棉花、無菌剪刀、稱量紙、不銹鋼藥匙、橡皮膠頭3只；
當(dāng)樣品瓶裝樣品時：石炭酸消毒紗布兩塊、開瓶器。
（一）、樣品處理（無菌操作）
Ø 樣品：瓶裝飲料或釀造酒類：
用點(diǎn)燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，用石炭酸紗布蓋好，再用滅菌的開瓶器將蓋打開，將含二氧化碳的樣品倒入一信滅菌瓶內(nèi)，加蓋假蓋，口勿蓋緊，在其上覆蓋在一塊滅菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部逸出后，媽樣進(jìn)行稀釋。
Ø 乳制品：
袋裝奶粉用75%的酒精棉球涂擦消毒袋口，以無菌操作取樣，放入滅菌的三角瓶內(nèi)，將225mL溫?zé)岬臏缇睇}水徐徐加入（先用少量生理鹽水將奶粉調(diào)成糊狀，再全部加入，以免結(jié)塊）。
（二）、 檢樣稀釋與乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)----[初發(fā)酵]（無菌操作）
1、 用無菌量筒量取225mL滅菌生理鹽水倒入滅菌玻璃瓶內(nèi)，用10ml移液管吸取9mL生理鹽水注入無菌試管中，共2支，備用?！?br />2、 以無菌操作將檢樣25mL(g)放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣用均質(zhì)器，以8 000～10000r/min的速度處理1min，做成1：10的均勻稀釋液。
3、 用10ml移液管吸取1：10的稀釋液10ml分別注入雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管中：共3支。
4、 用1ml移液管吸取1∶10的稀釋液1ml分別注入單料乳糖膽鹽發(fā)酵管中：共3支。
5、 用同上一支1mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，換一支吸管，吸吹5次，或振搖試管混勻，做成1∶100的稀釋液。再用這支吸管吸取1∶100稀釋液1mL分別注入單料乳糖膽鹽發(fā)酵管中：共3支。
² 注意：做10倍遞增稀釋時，每遞增稀釋一次，要換用1支1mL滅菌吸管。
² 放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)：
將接種后的乳糖膽鹽發(fā)酵管置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者（培養(yǎng)液由紫藍(lán)色變成黃色并有氣泡），則按下列程序進(jìn)行試驗(yàn)。
（第二天）進(jìn)行EMB平板分離，[EC肉湯、蛋白胨水接種（糞大腸菌群檢驗(yàn)）]：（無菌操作）
所需培養(yǎng)基與器材：
u 培養(yǎng)基：
1. EMB瓊脂平板 5只
2. EC肉湯： 5支
3. 蛋白胨水： 5支
u 器材：
44.5±0.2℃水浴箱，接種環(huán)。
（一）、接種EMB平板進(jìn)行分離培養(yǎng)
將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在EMB瓊脂平板上（一管對一個平板），置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并挑取可疑菌落做：革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。
在EMB平板上的典型菌落：呈紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常有金屬光澤。由于藥物影響，亦呈現(xiàn)紫色、粉紫、中心灰紫、無黑心、濕潤等，常為大腸桿菌，均應(yīng)注意挑選。
（二）、接種EC肉湯（用于糞大腸菌群檢驗(yàn)）
用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于EC肉湯管內(nèi)（一管對一個管），置44.5±0.2℃水浴箱內(nèi)(水浴箱內(nèi)的水面應(yīng)高于EC肉湯液面)，培養(yǎng)24±2h。經(jīng)培養(yǎng)后，如所有EC肉湯管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告：為陰性；如有產(chǎn)氣者，則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1℃培養(yǎng)18～24h，凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為糞大腸菌群陽性。
（三）、接種蛋白胨水：（用于糞大腸菌群檢驗(yàn)）
用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于蛋白胨水內(nèi)（一管對一個管 ），置44.5±0.2℃水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h。同時取一蛋白胨水培養(yǎng)基不接種，一起培養(yǎng)做對照試驗(yàn)。
（第三天）進(jìn)行乳糖發(fā)酵（證實(shí)試驗(yàn)）接種、鏡檢、靛基質(zhì)試驗(yàn)、觀察EC肉湯發(fā)酵結(jié)果
所需培養(yǎng)基與器材：
u 培養(yǎng)基：
1. 乳糖發(fā)酵管：5支
2. 靛基質(zhì)試劑、（歐—波試劑）
3. 革蘭氏染色液
u 器材：顯微鏡
（一）、乳糖發(fā)酵接種
　　在EMB平板上的典型菌落：呈紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常有金屬光澤。由于藥物影響，亦呈現(xiàn)紫色、粉紫、中心灰紫、無黑心、濕潤等，常為大腸桿菌，均應(yīng)注意挑選
從EMB平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1～2個同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。
（二）、進(jìn)行鏡檢
從EMB平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1～2個進(jìn)行革蘭氏染色。大腸菌群菌：革蘭氏染色陰性無芽胞短桿菌。
（三）、進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)
向培養(yǎng)后的蛋白胨水中沿管壁加入靛基質(zhì)試劑（歐—波試劑）0.5mL，靜置片刻，觀察液面。陽性反應(yīng)者，液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。則證實(shí)為糞大腸菌群陽性。
（四）、觀察EC肉湯發(fā)酵結(jié)果
如所有EC肉湯管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告：為陰性；如有產(chǎn)氣者，則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1℃培養(yǎng)18～24h，凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)：為糞大腸菌群陽性。
（第四天）觀察乳糖發(fā)酵結(jié)果及器材的消毒和清洗
（一）、觀察乳糖發(fā)酵結(jié)果
觀察：乳糖發(fā)酵管內(nèi)是否有氣體產(chǎn)生
u 凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。
（二）、查表報(bào)告結(jié)果
　　根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。
根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN值。